FDA（熒光素二乙酸酯）是一種非熒光疏水性熒光素衍生物，可以通過細(xì)胞膜（包括哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞），因此細(xì)胞內(nèi)酯酶水解產(chǎn)生高熒光產(chǎn)物熒光素的二乙酸酯基團(tuán)。熒光素分子在具有完整膜的細(xì)胞中積累，作為細(xì)胞活力的標(biāo)記。不具有完整細(xì)胞膜或活性代謝的細(xì)胞可能不會(huì)積聚熒光產(chǎn)物，因此不會(huì)表現(xiàn)出綠色熒光。FDA可以與PI染色組合使用，因?yàn)榉腔罴?xì)胞攝取PI并將死細(xì)胞染成紅色，而活細(xì)胞不吸收PI并且應(yīng)該僅染色綠色。與單色分析相比，非活細(xì)胞和活細(xì)胞的這種雙色分離可以提供更準(zhǔn)確的細(xì)胞活力定量。

 操作步驟 1.準(zhǔn)備2-10 mM DMSO儲(chǔ)備溶液 將4.2mg溶于1ml DMSO中以制備10mM儲(chǔ)備溶液（1mg / ml相當(dāng)于~2.4mM） 注意：應(yīng)立即使用原液; 應(yīng)將任何剩余的溶液等分并在<-20℃冷凍。 避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。 

               2.準(zhǔn)備染料工作溶液 在使用之前，通過用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（pH7）稀釋步驟1中的DMSO儲(chǔ)備溶液，準(zhǔn)備1至20μM染料工作溶液。通過渦旋混合均勻。   

               3.用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞：

              3.1用測(cè)試化合物細(xì)胞培養(yǎng)一段所需的時(shí)間。

              3.2離心細(xì)胞，每管2-10×105個(gè)細(xì)胞。 

              3.3在500μL染料工作溶液中重懸細(xì)胞（來自步驟2）。 

              3.4在室溫或37°C下用染料溶液孵育細(xì)胞15至30分鐘，避光。 

              3.5從細(xì)胞中取出染料工作溶液，用HHBS或您選擇的緩沖液清洗細(xì)胞。 將細(xì)胞重懸于500μL預(yù)熱的HHBS或培養(yǎng)基中，得到每管2-10×105個(gè)細(xì)胞。

              3.6用流式細(xì)胞儀（FL1通道）或熒光顯微鏡觀察Ex / Em = 490 / 520nm處的熒光變化。 注意：對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞染色：當(dāng)通過測(cè)試細(xì)菌過夜生長預(yù)處理的營養(yǎng)肉湯中1：800稀釋儲(chǔ)備溶液時(shí)，染色是最有效的，但也可以使用新鮮營養(yǎng)肉湯或PBS。 

                  細(xì)菌懸浮液應(yīng)用PBS 稀釋至每毫升105-107個(gè)生物。 可以通過將1ml溶液施加到.45μm過濾器（25mm）并真空過濾除去溶液，然后加入1ml染料溶液并在室溫下孵育5-10分鐘來染色細(xì)菌。